第3回 2019/8/1 3限
- 講師：伊藤隆司
- 参考書：現代生物科学入門１：ゲノム科学の基礎
- 参考書：ゲノム医学 メディカルサイエンスインターナショナル
次世代シーケンサー
以下の３種類が主流だが、主に使われているのは真ん中のillumina社のシークエンサー。
- Roche 454 Genome Sequencer FLX
- Pyrosequencing
- \(250\text{ nt}\times0.4\text{ M}=0.1\text{ Gb/run}(8\text{h})\)
- Illumina-Solexa Genome Analyzer
- Sequencing by synthesis
- \(50\text{ nt}\times80\text{ M}=4\text{ Gb/run}(3\text{d})\)
- ABI SOLiD
- Sequencing by synthesis
- \(50\text{ nt}\times200\text{ M}=10\text{ Gb/run}(5\text{d})\)
Pyrosequencing
- 相補的な \(\mathrm{dNTP}\) を加えた時に塩基伸長が起き、\(\mathrm{PPi}\)（ピロリン酸）ができる。
- 遊離した \(\mathrm{PPi}\)（ピロリン酸）と反応してSulfurylaseが \(\mathrm{ATP}\) を産生する。
- この \(\mathrm{ATP}\) がLuciferase発光をカスケードする。
$$
\begin{aligned}
\mathrm{DNA_N} + \mathrm{dNTP}
&\xrightarrow{\text{Polymerase}}\mathrm{DNA_{N+1}}+\mathrm{PPi}\\
\mathrm{PPi} + \mathrm{APS}
&\xrightarrow{\text{Sulfulylase}}\mathrm{ATP}\\
\mathrm{ATP} + \mathrm{O_2} + \mathrm{Luciferin}
&\xrightarrow{\text{Luciferase}}\mathrm{AMP} + \mathrm{PPi} + \mathrm{CO_2} + \mathrm{Oxyluciferase} + \mathrm{Light}
\end{aligned}
$$
454(Roche)
上記の反応を徹底的にマイクロ化した。（ピコリットル \(10^{-12}\mathrm{L}\) で反応。第一世代の100万分の1のスケール）
一つのDNA吸着ビーズに1分子のDNAを結合させて、水と油のエマルジョン中でPCR増幅をする。これに寄って個々のビーズが大腸菌のクローンに相当する役割を発揮する。
Solexa
何が違うのか？
| # | 第1世代 Sanger法 |
第2世代 SBS |
第3世代 SMRT/Nanopore |
|---|---|---|---|
| 鋳型調製 | |||
| 反応 | |||
| 読み取り | 電気泳動装置 | 反応と読み取りが一体化 | 反応と読み取りが一体化 |
| 正確性 | ◯ | △ | × |
| 出力 | × | ◯ | △ |
| リード長 | △ | × | ◯ |
第四世代?
Post-light sequencer
- Oxford Nanopore：
DNAポリメラーゼの一分子観察。ナノポアをDNAまたはヌクレオチドが通過する際の電気抵抗の変化を読み取る。
一分子を読むが故に
- 試薬の濃度が100%ということはないので、色がついていないものを使って伸長反応が行われてしまう。
- DNAポリメラーゼの精度にもよる（間違えて酵素反応をしたが校正機能によってやり直した、などでも読み取りミスが生じる。）
- Ion Torrent：
ヌクレオチドの取り込みで生じる \(\mathrm{H}^{+}\) を計測（中身はただのpHメーター）
個人ゲノム解読
| ヒトゲノム計画 | 個人ゲノム解読 |
|---|---|
| de novo sequencing（新規） | re-sequencing（お手本あり） |
| 誰か特定の人のゲノムではない（混合物） | リアルな個人のゲノム |
| 二倍体ゲノムではない（データは一本） | 二倍体ゲノムを目指す |
ヒトゲノム多様性のオーダー
| 多様性 | オーダー |
|---|---|
| ゲノムサイズ | \(10^9\) |
| SNP | \(10^6\) |
| Indel | \(10^5\) |
| 非同義置換 | \(10^4\) |
| SV(Structural Variation) | \(10^3\) |
| 遺伝子機能低下 | \(10^2\) |
| 遺伝子機能喪失 | \(10\) |
これかのゲノミクス
- 個人ゲノミクス
- 二倍体：完璧なゲノム
- コホート：集団
- 単一細胞ゲノミクス
- 脳
- がん
ゲノムコホート
- コホート研究
- あらかじめ生活習慣などを調査しておき、その後の病気の発生率を比較する疫学研究。
- 病気になった人の過去を遡る症例対照研究とは異なり、未来に向かって追跡調査を行う。
- ゲノムコホート研究
- ゲノム配列も含めたオーミクス情報も調査
- 生体試料をバンク化（バイオバンク）
- 臨床情報も含めたデータベース化
- 10万人を超える規模で展開